25-06-2023
Лактоферрин
|
||||||||||||||
Рекомбинантный лактоферрин человека. Диаграмма основана на 1b0l. |
||||||||||||||
Доступные структуры: 1b0l, 1bka, 1cb6, 1dsn, 1eh3, 1fck, 1h43, 1h44, 1h45, 1hse, 1l5t, 1lcf, 1lct, 1lfg, 1lfh, 1lfi, 1lgb, 1n76, 1sqy, 1vfd, 1vfe, 1z6v, 1z6w, 2bjj | ||||||||||||||
Идентификаторы | ||||||||||||||
Символ | LTF; GIG12; HLF2 | |||||||||||||
Другие Идентификаторы | OMIM: 150210 96837 1754 | |||||||||||||
|
||||||||||||||
Ортологи | ||||||||||||||
Человек | Мышь | |||||||||||||
Entrez | 4057 | 17002 | ||||||||||||
Ensembl | n/a | ENSMUSG00000032496 | ||||||||||||
Uniprot | n/a | Q3TP24 | ||||||||||||
Refseq | NM_002343 (мРНК) NP_002334 (белок) |
NM_008522 (мРНК) NP_032548 (белок) |
||||||||||||
Хромосомная локализация | n/a | Chr 9: 110.86 - 110.89 Mb | ||||||||||||
Поиск по Pubmed | [1] | [2] |
Лактоферрин — полифункциональный белок из семейства трансферринов. Лактоферрин является глобулярным гликопротеином с молекулярной массой около 80 кДа и широко представлен в различных секреторных жидкостях, таких как молоко, слюна, слезы, секреты носовых желез.
Лактоферрин является одним из компонентов иммунной системы организма, принимает участие в системе неспецифического гуморального иммунитета, регулирует функции иммунокомпетентных клеток и является белком острой фазы воспаления.
Белок взаимодействует с ДНК и РНК, полисахаридами, гепарином, причем некоторые из своих биологических функций лактоферрин проявляет в виде комплексов с этими лигандами.
Содержание |
Лактоферрин принадлежит к семейству белков-трансферринов, осуществляющих перенос железа в клетки и контролирующих уровень свободного железа в крови и во внешних секретах. Лактоферрин представлен в молоке человека и других млекопитающих.[1]
Было показано, что помимо молока лактоферрин содержится в плазме крови, нейтрофилах и является одним из основных белков практически всех экзокринных секретов млекопитающих, таких как слюна, желчь, слезы, секрет поджелудочной железы.[2] Концентрация лактоферрина в молоке изменяется от 7 мг/мл в молозиве до 1 мг/мл в зрелом молоке.
Согласно данным рентгеноструктурного анализа белок образован одной полипептидной цепью, которая содержит 692 аминокислотных остатка и образует два гомологичных глобулярных домена, называемых N- и С-долями (N-доля, остатки 1–333; C-доля, остатки 345–692), концы которых соединены короткой α-спиралью.[3][4]
Каждая доля состоит из двух доменов N1, N2 и C1, C2 и содержит один железосвязывающий сайт и один сайт гликозилирования. Степень гликозилирования белка может быть различной. Именно поэтому молекулярная масса белка по разным данным составляет от 76 до 80 кДа. Было показано, что устойчивость лактоферрина к деградации протеазами или при низких значениях рН обусловлена высокой степенью гликозилирования белка.[5]
Лактоферрин относится к щелочным белкам, его изоэлектрическая точка составляет 8.7. Белок существует в двух формах – железонасыщенной (холо-ЛФ) и железоненасыщенной (апо-ЛФ). Их третичные структуры различны; для апо-ЛФ характерна “открытая” конформация N-доли и “закрытая” конформация С-доли, а для холо-ЛФ характерна закрытая конформация обеих долей.[6]
Каждая молекула белка может обратимо связывать два иона трехвалентного железа или ионы цинка, меди и других металлов.[7] Центры связывания локализованы в каждой из двух белковых глобул, составляющих молекулу лактоферрина. В каждой доле атом железа скоординирован с шестью лигандами, четыре из которых предоставлены цепью полипептида (два остатка тирозина, один остаток гистидина и один остаток аспарагиновой кислоты), а оставшиеся две связи железо образует с ионом карбоната или бикарбоната.
Лактоферрин образует с железом комплекс красноватого цвета. Его сродство к железу в 300 раз выше, чем сродство трансферрина.[8] Кроме того, показано, что в слабокислой среде сродство белка к железу повышается, что облегчает переход металла с трансферрина на лактоферрин при воспалении, когда рН тканей снижается за счет молочной и других кислот.[9] Степень насыщения железом лактоферрина женского молока составляет по оценкам разных авторов от 10 до 30 %. Показано, что белок участвует не только в транспорте ионов железа, цинка и меди, но и в регуляции их всасывания.[10] Наличие непрочно связанных ионов цинка и меди не влияет на железосвязывающую функцию лактоферрина, и фактически даже усиливает ее.
Как в плазме крови, так и в секреторных жидкостях лактоферрин может существовать в виде различных полимерных форм от мономера до тетрамера. Показано, что белок обнаруживает резко выраженную тенденцию к полимеризации in vitro и in vivo, и при высоких концентрациях преобладают полимерные формы лактоферрина.[9]
Кроме того, рядом авторов было обнаружено, что доминирующей формой лактоферрина в физиологических условиях является тетрамер; соотношение мономер : тетрамер при концентрации белка 10−5 М составляет 1 : 4.[11][12][13]
Существует предположение, что олигомерное состояние лактоферрина определяется концентрацией данного белка в среде. Кроме того, полимеризация лактоферрина строго зависит от присутствия ионов Ca2+. В присутствии ионов кальция и при концентрации белка менее 10−10-10−11 M наблюдали преобладание мономерной формы белка. При концентрациях лактоферрина более 10−9-10−10 M происходил переход в тетрамерную форму.[14][11] Титр лактоферрина в крови соответствует величине именно этой “переходной концентрации” и, таким образом, лактоферрин в крови должен быть представлен как в виде мономера, так и тетрамера.
Также было показано, что ряд функциональных свойств лактоферрина определяется олигомерным состоянием молекулы белка. Так, лактоферрин в виде мономера способен к прочному связыванию с ДНК и регуляции процессов гранулопоэза, а тетрамерная форма не связывает ДНК. Есть все основания полагать, что в организации олигомерного состояния белка участвуют слабые взаимодействия — преимущественно гидрофобные и электростатические контакты боковых групп остатков аминокислот молекулы лактоферрина и, возможно, гликозидных остатков белка.
Лактоферрин относится к системе врожденного иммунитета. Существуют данные о том, что лактоферрин опосредованно вовлечен в процессы клеточного иммунитета. Главные биологические функции белка — это связывание и транспорт ионов железа, но кроме этого лактоферрин обладает антибактериальной, антивирусной, антипаразитарной, различными каталитическими активностями, а также противораковым, антиаллергическим, иммуномоделирующим действиями и радиопротективными свойствами.
Наиболее изученным является механизм антибактериальной активности лактоферрина. Антибактериальные свойства белка обусловлены способностью лактоферрина связывать железо и тем самым лишать бактериальную микрофлору необходимого для ее роста и жизнедеятельности микроэлемента.[15] Бактерицидные свойства белка также обусловлены наличием специфических лактоферриновых рецепторов на клеточной поверхности микроорганизмов. Показано, что лактоферрин связывается с липополисахаридами (ЛПС) бактериальных стенок, и входящая в состав белка окисленная форма железа инициирует их перекисное окисление. Это приводит к изменению мембранной проницаемости и последующему лизису клеток.[15]
Все вышеперечисленные механизмы антибактериального действия лактоферрина напрямую зависят от железосвязывающих свойств белка. Вместе с тем в основе антиинфекционной активности лактоферрина могут лежать и другие механизмы, не зависящие от способности белка связывать ионы железа, например стимулирующее действие лактоферрина на фагоцитоз и влияние на активность комплемента.[16] Однако наиболее изученным механизмом антибактериального действия белка, не зависящим от его железосвязывающей способности, является специфическое взаимодействие лактоферрина с наружной бактериальной мембраной, которое приводит к гибели клеток бактерий.[17] Было показано, что белок разрушает бактериальную мембрану и даже проникает внутрь клетки. За специфическое связывание с бактериальной стенкой ответственен лактоферрицин — пептид, расположенный на N-конце молекулы лактоферрина и получаемый in vitro протеолитическим расщеплением белка трипсином.[18][19]
Показано, что лактоферрин обладает антивирусной активностью против широкого спектра вирусов человека и животных с ДНК и РНК геномами.[20] Лактоферрин связывает различные антигены вирусной природы преимущественно в условиях in vitro. На данный момент показано действие белка против вирусов простого герпеса 1 и 2,[21][22] цитомегаловируса,[23] ВИЧ,[22][24]вируса гепатита С,[25][26] хантавирусов, ротавирусов, полиовирусов первого типа,[19] аденовирусов,[27] респираторного синцитиального вируса, мышиного вируса лейкоза Френда.[19]
Наиболее изученным механизмом антивирусной активности лактоферрина является предотвращение попадания вирусных частиц в клетки-мишени. Многие вирусы имеют тенденцию связываться с гепарансульфат-гликозоаминогликанами и липопротеинами мембран эукариотических клеток. После первоначального контакта с клеткой вирусная частица взаимодействует со специфическими вирусными рецепторами и проникает в клетку.[26] Лактоферрин связывается с гепарансульфат-гликозоаминогликанами и липопротеинами на поверхности клеток, препятствуя тем самым связыванию с ними вирусных частиц и дальнейшему проникновению вируса в клетку. Интересно, что лактоферрицин, который обеспечивает основные антимикробные свойства лактоферрина, практически не проявляет антивирусной активности. Кроме того, апо-ЛФ в большинстве случаев показывает гораздо большее антивирусное действие, чем металлонасыщенный лактоферрин.[20]
Помимо взаимодействия с клеточными рецепторами, лактоферрин напрямую связывается с вирусными частицами и препятствует их проникновению в клетки. Это подтверждается наличием антивирусного действия белка против ротавирусов,[19] для которых клеточными рецепторами являются углеводные остатки, отличающиеся по составу от гликозаминогликанов. Кроме того, было показано взаимодействие лактоферрина с белками оболочки вируса гепатита.[26] Последним моментом в развитии антивирусной активности белка является ингибирование вирусной репликации уже после попадания вируса в клетку.[19][24] Такое непрямое противовирусное влияние осуществляется за счет регуляции синтеза натуральных киллеров, гранулоцитов и макрофагов -– клеток, которые играют решающую роль на ранних стадиях развития вирусной инфекции. Методами ПЦР в реальном времени и при помощи ДНК-микрочипов показано повышение экспрессии гена лактоферрина при тяжелом остром респираторном синдроме (SARS).[28]
Показано, что лактоферрин и лактоферрицин ингибируют in vitro рост Trichophyton mentagrophytes, который вызывает ряд кожных заболеваний, например, стригущий лишай.[29] Лактоферрин обладает активностью против Candida albicans -- симбионтов, образующих колонии в слизистой оболочке ротовой полости здоровых людей.[30][31] Тем не менее, этот вид является основным грибковым патогеном у людей с оппортунистическими инфекциями ротовой полости и организма в целом, а также у иммуннодефицитных больных. Долгое время в качестве основного антигрибкового препарата против Candida albicans, использовали флюконазол, что привело к появлению штаммов, устойчивых к воздействию этого лекарства. Было показано, что лактоферрин в комплексе с флюконазолом обладает антигрибковой активностью против флюконазол-устойчивых штаммов Candida albicans, также других видов Candida: C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis и C. tropicalis.[30] Антигрибковая активность наблюдается только в случае последовательной инкубации клеток Candida с лактоферрином, а потом с флюконазолом, но не наоборот. Лактоферрицин обладает антигрибковой активностью, превосходящей активность самого лактоферрина. В составе лактоферрицина изучали два пептида, содержащие 1-11 и 17-26 аминокислотные остатки лактоферрина. Синтетически синтезированный пептид 1-11 обладает гораздо большей активностью против Candida albicans, чем нативный ЛФ.[30] Кроме того, показано, что пептид, содержащий 4-11 аминокислотные остатки, не вызывает гибели клеток Candida, что указывает на важность 1-4 аминокислот белка в проявления антигрибковой активности.[32] Исследования синтетического пептида 17-26 показали, что он стимулирует образование гидроксильных радикалов мышиными нейтрофилами и в комбинации с антигрибковым препаратом амфотерицином В защищает животных от летальных для них инфекций Candida albicans и Aspergillus fumigatus в гораздо большей степени, чем амфотерицин В один. Причем in vitro антигрибковая активность пептида была в 10 раз ниже, чем активность амфотерицина В.[33]
Оральное введение лактоферрина через питьевую воду мышам с ослабленным иммунитетом и симптомами стоматита приводило к значительному уменьшению числа Candida albicans в ротовой полости и размеров повреждения языка.[34] Показано, что оральное введение лактоферрина уменьшает количество патогенных организмов в тканях, близких к желудочно-кишечному тракту у нескольких моделей инфицированных животных. Более того, ВИЧ-инфицированные больные с Candida albicans, устойчивые к антигрибковым препаратам, полностью избавлялись от грибковой инфекции после введения смеси, содержащей лактоферрин, лизоцим и интроаконазол.[35]
В отличие от антивирусного и антибактериального действия лактоферрина, очень мало известно о противогрибковом механизме действия белка. Показано, что антигрибковая активность лактоферрина обеспечивается разрушением клеточной стенки и связыванием белка с плазматической мембраной C. albicans. Действие лактоферрина на C. albicans in vitro приводит к изменению мембранного потенциала и закислению цитоплазмы клеток Candida, что говорит о прямом или косвенном взаимодействии лактоферрина с плазматической мембраной.[31]
Поскольку лактоферрин позволяет минимизировать концентрации лекарств, при которых происходит эффективное лечение грибковых инфекций, возможно его использование совместно с противогрибковыми препаратами в терапии заболеваний, вызываемых штаммами с лекарственной устойчивостью. Синергическое действие лактоферрина с антибиотиками, антигрибковыми и антибактериальными препаратами против патогенных микроорганизмов может быть очень эффективным. Кроме того, использование лактоферрина, который является одним из факторов неспецифической защиты в слюне, позволяет уменьшить распространение флюконазол-устойчивых видов Candida среди людей с ослабленной иммунной системой, в частности среди больных СПИДом.[36]
Взаимодействие белков c ДНК является объектом многочисленных исследований, направленных на рассмотрение механизмов, контролирующих экспрессию генов.[11][37] Поэтому одним из важных свойств лактоферрина считают его способность связываться с нуклеиновыми кислотами. Обнаружено, что фракция белка, выделенного из молока, содержит 3.3 % РНК,[11] кроме того, при взаимодействии с одноцепочечной и двуцепочечной ДНК белок предпочтительнее связывается с двуцепочечной ДНК. Взаимодействие лактоферрина с ДНК частично ингибировалось добавлением антител к ДНК, полученных из плазмы крови больных системной красной волчанкой.
Способность лактоферрина связывать ДНК активно используется многими исследователями для выделения и очистки белка с помощью аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованными ДНК-содержащими сорбентами. Была предложена методика выделения лактоферрина из молочной плазмы на агарозе с иммобилизованной одноцепочечной ДНК.[38] При выделении белка из мочи новорожденных на этом сорбенте было обнаружено, что при прохождении через желудочно-кишечный тракт кроме неповрежденного лактоферрина (78 кДа) образуются два фрагмента 51 и 39 кДа, которые также связывают ДНК.[14]
Лактоферрин гидролизует РНК и проявляет свойства пиримидин-специфических секреторных рибонуклеаз.
Сравнительный анализ данных рентгеноструктурного анализа лактоферрина и комплекса РНКазы А с аналогом субстрата 2’-5’ CpG в совокупности с анализом гомологии первичной последовательности этих двух белков показал наличие в молекуле лакоферрина структурных мотивов, подобных активному центру белков суперсемейства РНКазы А. Используя метод молекулярного моделирования, был проведен анализ топографии потенциального активного центра лактоферрина по аналогии с таковым для РНКазы А.[39] Кандидатами на роль ключевых аминокислотных остатков РНК-гидролизующего центра лактоферрина являются остатки аминокислот His-91, His-246 и Lys-237, которые находятся в оптимальной для катализа ориентации к другим ближайшим остаткам в возможном активном центре. Субстрат-связывающий участок образуют Asp-244, Lys-241 и Thr-90. Таким образом, потенциальный РНКазный центр лактоферрина расположен в междоменной области белка.
Способность лактоферрина гидролизовать РНК открывает еще один аспект функций белка в организме, так как показано, что РНКазы молока путем разрушения РНК-генома ингибируют обратную транскрипцию ретровирусов, вызывающих рак молочной железы у мышей.[40] Было показано, что у женщин группы Парси в Западной Индии уровень РНКаз молока заметно ниже такового в остальных группах, а частота заболеваемости раком молочной железы превышает в три раза среднестатистическую заболеваемость.[41] Таким образом, можно предположить, что РНКазы молока и лактоферрин в частности играют важную роль в патогенезе заболеваний, вызываемых различными ретровирусами.
Также было показано, что изоформы лактоферрина обладают нуклеазными и фосфатазными активностями.[42] Гидролиз олигодезоксирибонуклеотидов лактоферрином протекал значительно медленнее, чем высокомолекулярных ДНК-субстратов. Исследуемая фракция белка не содержала ионов железа. Оптимальное значение pH реакционной смеси при гидролизе ДНК оценено близким 7.0-7.5. Эта величина значительно превышает значение рН оптимума других известных ДНКаз (5.0-5.5 у ДНКазы II крови человека). Кроме того по таким свойствам, как активация каталитической функции низкомолекулярными эффекторами и ионами металлов, лактоферрин существенно отличается от других ферментов с ДНКазной активностью.[43]
Была показана нуклеотид-гидролизующая активность препаратов лактоферрина.[42] Лактоферрину, помимо АТРазной активности, принадлежит активность, отщепляющая фосфатную группу от любых рибо- и дезоксирибонуклеозид- моно-, ди- и трифосфатов. Лактоферрин обладает свойствами неспецифической нуклеозид-5’-моно-, ди- и трифосфатфосфатазы, которую назвали нуклеотидфосфатазой.[42] При этом скорости дефосфорилирования нуклеотидов ниже, чем для классических АТРаз и нуклеозидаз, но сравнимы с таковыми или даже выше, чем для других широко распространенных ферментов, типа эндонуклеаз рестрикции.[44][45] Показано, что АТР-гидролизующая активность является железонезависимым свойством белка, а конформационные перестройки, вызванные координацией ионов железа, не влияют на АТРазный центр молекулы.[42]
Показано, что не разделенные на изоформы препараты лактоферрина разных доноров гидролизовали только 4,6-этилиден(G7)-п-нитрофенил-(G1)-a,D-мальтогептаозид, но не другие олигосахариды с иными связями между моносахаридными остатками (целлобиоза, лактоза, сахароза).[42] Препараты лактоферрина катализировали гидролиз мальтогептаозида с Km = (2.0±0.9) мМ. В целом эта величина Km для мальтогептаозида сопоставима или даже выше, чем таковые для α-амилазы (0.2-5 мМ) и каталитически активных антител молока и крови больных аутоиммунными заболеваниями (~ 10−4 М).[46][47]
Изучено 60 последовательностей генов лактоферрина 11 видов млекопитающих.[48] У большинства видов, стоп-кодоном является TAA
, и TGA
у Mus musculus. Кодирующая часть из-за делеций, инсерций, а также мутаций стоп-кодонов значительно отличается и имеет длину от 2,055 до 2,190 пар нуклеотидов. Полиморфизм генов между видами существенно превышает внутривидовой полиморфизм лактоферрина. Обнаружены отличия в аминокислотных последовательностях: 8 у Homo sapiens, 6 у Mus musculus, 6 у Capra hircus, 10 у Bos taurus, и 20 в случае Sus scrofa. Такой разброс может свидетельствовать о функциональных отличиях лактоферринов разных видов.[48]
У человека ген лактоферрина LTF располагается на третьей хромосоме, в локусе 3q21-q23.
У быка кодирующая последовательность состоит из 17 экзонов и имеет длину около 34,5 тысяч пар нуклеотидов. Экзоны гена лактоферрина быка имеют сходный размер с экзонами других генов семейства трансферринов, в то время как размеры интронов внутри семейства отличаются. Эволюционное сходство размеров экзонов и их распределения в доменах белковой молекулы указывает на то, что ген лактоферрина произошел путем дупликации. Последовательность промотороного участка гена лактоферрина быка не имеет некоторых участков связывания энхансеров транскрипции по сравнению с соответствующии последовательностями гена лактоферрина человека и мыши, что объясняет относительно низкую экспрессию гена лактоферрина у быка.[49]
Изучение полиморфизма генов, кодирующих лактоферрин, может способствовать выведению пород сельскохозяйственных животных, устойчивых к маститу.[50]
Рецептор лактоферрина играет важную роль в процессе интернализации лактоферрина и облегчает абсорбцию ионов железа, связанных с лактоферрином. Методом количественной ПЦР было показано повышение экспрессии рецептора лактоферрина с возрастом в двенадцатиперстной кишке и снижение экспрессии в тощей кишке.[51]
Антимикробные пептиды: содержимое гранул гранулоцитов | |
---|---|
Азурофильные гранулы: | Миелопероксидаза · Дефензины · нейтральные сериновые протеазы (Протеиназа 3) · Лизоцим · BPI-белок · Коллагеназа |
Специфические гранулы нейтрофилов: | Щелочная фосфатаза · Лактоферрин · Лизоцим · НАДФ-оксидаза · Коллагеназа · Кателицидин |
Гранулы эозинофилов: | Катепсины · Главный щелочной белок · Катионный белок эозинофилов · Пероксидаза эозинофилов · Нейротоксин эозинофилов (белок X) · Гистаминаза · Коллагеназа · Кислая фосфатаза · Арилсульфатаза |